ARKEOGENETİKTE YÖNTEMLER

DNA EKSTRAKSİYON YÖNTEMLER 

Bir arkeolojik alandan bir örnek toplandıktan sonra, bir dizi işlemle DNA elde edilebilir. [1] Daha yaygın yöntemlerden biri silika kullanır ve kemik örneklerinden eski DNA toplamak için polimeraz zincir reaksiyonlarından yararlanır. [2]

Fosillerden antik DNA’yı çıkarmaya ve onu analize hazırlamaya çalışırken zorluğu artıran birkaç zorluk vardır. DNA sürekli bölünüyor. Organizma canlı iken bu bölünmeler onarılır; bununla birlikte, bir organizma öldüğünde, DNA tamir edilmeden bozulmaya başlayacaktır. Bu, yaklaşık 100 baz çifti uzunluğunda DNA iplikçiklerine sahip numunelerle sonuçlanır. Kontaminasyon, süreç boyunca birden fazla adımda bir başka önemli zorluktur. Çoğu zaman, bakteriyel DNA gibi başka DNA, orijinal numunede bulunacaktır. Antik DNA çıkarma çalışmaları için ayrı havalandırma sistemleri ve çalışma alanları gibi birçok önlemin alınması kontaminasyonu önlemek için gereklidir.[3] Kullanılacak en iyi örnekler taze fosillerdir, çünkü dikkatsiz yıkama küf oluşumuna neden olabilir.[1] Fosillerden gelen DNA da zaman zaman DNA replikasyonunu engelleyen bir bileşik içerir.[4] Numunelerin benzersizliğinden kaynaklanan tekrarlanabilirlik eksikliği nedeniyle, zorlukları azaltmada hangi yöntemlerin en iyi olduğu konusunda bir fikir birliğine varmak da zordur. [3]

Silika bazlı DNA ekstraksiyonu, arkeolojik kemik artefaktlarından DNA çıkarmak ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri kullanılarak amplifiye edilebilen DNA elde etmek için saflaştırma adımı olarak kullanılan bir yöntemdir.[4] Bu süreç, DNA’yı bağlamak ve onu PCR amplifikasyonunu engelleyen fosil sürecinin diğer bileşenlerinden ayırmak için bir araç olarak silika kullanarak çalışır. Bununla birlikte, silikanın kendisi de güçlü bir PCR inhibitörüdür, bu nedenle ekstraksiyondan sonra silikanın DNA’dan çıkarılmasını sağlamak için dikkatli önlemler alınmalıdır. [5] Silika bazlı yöntem kullanılarak DNA ekstraksiyonu için genel süreç aşağıda özetlenmiştir: [6]

  1. Kemik örneği temizlenir ve dış tabaka kazınır
  2. Numune tercihen kompakt bölümden alınır
  3. Numune ince toz haline getirilir ve DNA’yı serbest bırakmak için bir ekstraksiyon çözeltisine eklenir
  4. DNA bağlanmasını kolaylaştırmak için silika çözeltisi eklenir ve santrifüjlenir
  5. Bağlama solüsyonu çıkarılır ve DNA’yı silikadan serbest bırakmak için solüsyona bir tampon eklenir.

Silika bazlı DNA ekstraksiyonunun ana avantajlarından biri, nispeten hızlı ve verimli olması, sadece basit bir laboratuvar kurulumu ve kimyasallar gerektirmesidir. Proses daha büyük veya daha küçük miktarları barındıracak şekilde ölçeklenebildiğinden, numune boyutundan da bağımsızdır. Diğer bir faydası ise işlemin oda sıcaklığında gerçekleştirilebilmesidir. Ancak bu yöntem bazı dezavantajlar içermektedir. Esas olarak silika bazlı DNA ekstraksiyonu sadece kemik ve diş örneklerine uygulanabilir; yumuşak doku üzerinde kullanılamazlar. Çeşitli farklı fosillerle iyi çalışsalar da, taze olmayan fosillerde daha az etkili olabilirler (örneğin, müzeler için işlenmiş fosiller).). Ayrıca kontaminasyon genel olarak tüm DNA replikasyonu için bir risk oluşturur ve bu yöntem kontamine materyale uygulandığında yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. [2]

Polimeraz zincir reaksiyonu, DNA parçalarını çoğaltabilen ve genellikle çıkarılan eski DNA’da kullanılan bir işlemdir. Üç ana adımı vardır: denatürasyon, tavlama ve uzatma. 

Denatürasyon, DNA’yı yüksek sıcaklıklarda iki tek zincire böler. Tavlama, Taq polimerazın DNA’ya bağlanmasına izin veren primer DNA ipliklerinin tek ipliklere bağlanmasını içerir. Uzatma, numuneye Taq polimeraz eklendiğinde ve iki tekli diziyi iki tam çift diziye dönüştürmek için baz çiftleriyle eşleştiğinde meydana gelir.[1] Bu işlem birçok kez tekrarlanır ve genellikle eski DNA ile kullanıldığında daha fazla sayıda tekrarlanır.[6] PCR ile ilgili bazı sorunlar, kısa diziler nedeniyle eski DNA için örtüşen primer çiftleri gerektirmesidir. Homojen olmayan örneklerde DNA analizini zorlaştırabilen PCR işlemi sırasında rekombinasyona neden olan “sıçrayan PCR” de olabilir.

DNA ANALİZİ YÖNTEMLERİ  

DNA, esas olarak kullanılarak sekanslanır edilen fosil kalıntıları elde Masif paralel dizileme,[7] eşzamanlı olarak amplifikasyonuna ve sıralama, bir numunedeki tüm DNA segmentlerinin, bu yüksek parçalanmış bile düşük konsantrasyon sağlar.[6] Jenerik primerlerin bağlanabileceği her bir zincire jenerik bir sekansın eklenmesini içerir ve böylece mevcut DNA’nın tamamı amplifiye edilir. Bu genellikle PCR’den daha maliyetli ve zaman alıcıdır, ancak eski DNA amplifikasyonunun içerdiği zorluklar nedeniyle daha ucuz ve daha verimlidir. [6] Margulies ve diğerleri tarafından geliştirilen bir toplu paralel dizileme yöntemi, boncuk bazlı emülsiyon PCR’yi kullanır vepiro,[8] çoğaltma potansiyel numunenin kaybı, şablonlarının, substrat rekabetini ve hata yayılma önler çünkü bulunmuştur bir DNA analizleri güçlü olması. [9]

aDNA dizisini analiz etmenin en yaygın yolu, onu diğer kaynaklardan bilinen bir diziyle karşılaştırmaktır ve bu, farklı amaçlar için farklı şekillerde yapılabilir.

Fosil kalıntısının kimliği, DNA dizisini BLASTN gibi bir yazılım kullanılarak bilinen türlerinkiyle karşılaştırarak ortaya çıkarılabilir.[9] Bu arkeogenetik yaklaşım, özellikle fosilin morfolojisi belirsiz olduğunda faydalıdır.[10] Bunun dışında bir aDNA dizisinde spesifik genetik belirteçler bulunarak tür tanımlaması da yapılabilir. Örneğin, Amerikan yerli popülasyonu, Wallace ve diğerleri tarafından tanımlanan spesifik mitokondriyal RFLP’ler ve delesyonlar ile karakterize edilir.[11]

aDNA karşılaştırma çalışması, iki tür arasındaki evrimsel ilişkiyi de ortaya çıkarabilir. Eski bir türün DNA’sı ile yakından ilişkili mevcut bir türün DNA’sı arasındaki baz farklılıklarının sayısı, bu iki türün son ortak atalarından ayrılma zamanını tahmin etmek için kullanılabilir.[7] phylogeny örneğin Avustralya keseli kurt ve Amerikan toprak gibi bazı soyu türleri, sloths, bu yöntemle imal edilmiştir.[7] Hayvanlardaki mitokondriyal DNA ve bitkilerdeki kloroplast DNA’sı, hücre başına yüzlerce kopyaya sahip oldukları ve bu nedenle eski fosillerde daha kolay erişilebildiği için genellikle bu amaç için kullanılır.[7]

İki tür arasındaki ilişkiyi araştırmak için başka bir yöntem de DNA hibridizasyonudur. Her iki türün tek sarmallı DNA bölümlerinin birbirleriyle tamamlayıcı çift bağ oluşturmasına izin verilir. Daha yakından ilişkili türler daha benzer bir genetik yapıya ve dolayısıyla daha güçlü bir hibridizasyon sinyaline sahiptir. Scholz et al. yürütülen güney leke melezleme üzerinde NeanderthalaDNA (Fosilden çıkarılan kalıntılar B-NW ve Krapina). Sonuçlar, zayıf antik insan-Neandertal hibridizasyonu ve güçlü antik insan-modern insan hibridizasyonu gösterdi. İnsan-şempanze ve neandertal-şempanze melezlemesi benzer şekilde zayıf güçtedir. Bu, insanlar ve neandertallerin aynı türden iki birey kadar yakın akraba olmadıklarını, ancak birbirleriyle şempanzelerden daha fazla akraba olduklarını gösteriyor.[1]

Antik türlerin değerli fenotipik bilgilerini sağlamak için aDNA’yı deşifre etmeye yönelik bazı girişimler de olmuştur. Bu, her zaman, bir çok benzer fenotipik özelliği paylaşan, iyi çalışılmış, yakından ilişkili bir türün karyotipine aDNA sekansının haritalanmasıyla yapılır. [9] Örneğin, Green ve ark. Neandertal Vi-80 fosilindeki aDNA dizisini modern insan X ve Y kromozom dizisiyle karşılaştırdılar ve sırasıyla 10.000’de 2.18 ve 1.62 bazda benzerlik buldular, bu da Vi-80 örneğinin bir erkek bireye ait olduğunu düşündürdü.[9] Diğer benzer çalışmalar arasında bulunması içerir mutasyon olarak cücelik ilişkili Arabidopsis eski Nübye olarak pamuk[29] ve Neandertallerde acı tat algı odağı üzerine araştırmadır. [12]

KAYNAKÇA : 

  1.  Hagelberg, ErikaClegg, JB (1991-04-22). “Arkeolojik Kemikten DNA İzolasyonu ve Karakterizasyonu”. Londra Kraliyet Cemiyeti Bildirileri B: Biyolojik Bilimler244(1309): 45-50. Bibcode:1991RSPSB.244…45Hdoi:10.1098/rspb.1991.0049ISSN0962-8452PMID1677195S2CID23859039.   
  2. Rohland, Nadin; Hofreiter, Michael (Temmuz 2007). “Kemiklerden ve dişlerden antik DNA ekstraksiyonu”Doğa Protokolleri2(7): 1756–62. doi: 10.1038/nprot.2007.247 . ISSN1754-2189PMID17641642.  
  3. Handt, O.; Höss, M.; Krings, M.; Pääbo, S. (1994-06-01). “Eski DNA: Metodolojik zorluklar”. deneyim50(6): 524–529. doi:10.1007/BF01921720ISSN0014-4754PMID8020612S2CID6742827.   
  4. Höss, M; Päabo, S (1993-08-11). “Pleistosen kemiklerinden silika bazlı saflaştırma yöntemiyle DNA ekstraksiyonu”Nükleik Asitler Araştırma21(16): 3913-3914. doi:10.1093/nar/21.16.3913ISSN0305-1048PMC 309938 . PMID8396242.   
  5. Yang, Dongya Y.; Müh, Barry; Waye, John S.; Dudar, J. Christopher; Saunders, Shelley R. (1998-04-01). “Silika bazlı döndürme kolonları kullanılarak antik kemiklerden geliştirilmiş DNA ekstraksiyonu”. Amerikan Fiziksel Antropoloji Dergisi . 105 (4): 539-43. doi : 10.1002/(sici)1096-8644(199804)105:4<539::aid-ajpa10>3.0.co;2-1 . ISSN 1096-8644 . PMID 9584894 .  
  6. Bouwman, Abigail; Rühli, Frank (2016-09-01). “Evrimsel tıpta arkeogenetik”. Moleküler Tıp Dergisi94(9): 971-77. doi:10.1007/s00109-016-1438-8ISSN0946-2716PMID27289479S2CID10223726.   
  7. Pääbo, Svante; Poinar, Hendrik; Seren, David; Jaenicke-Despres, Viviane; Hebler, Juliane; Rohland, Nadin; Kuch, Melanie; Krause, Johannes; Uyanık, Linda (2004). “Eski DNA’dan genetik analizler”. Genetiğin Yıllık İncelemesi38: 645-79. doi:10.1146/annurev.genet.37.110801.143214ISSN0066-4197PMID15568989.  
  8. Margulies, Marcel; Egholm, Michael; Altman, William E.; Atiye, Said; Bader, Joel S.; Bemben, Lisa A.; Berka, Ocak; Braverman, Michael S.; Chen, Yi-Ju (2005-09-15). “Mikrofabrike yüksek yoğunluklu pikolitre reaktörlerinde genom dizilimi” . Doğa . 437(7057): 376-380. Bibcode : 2005Natur.437..376M . doi : 10.1038/nature03959 . ISSN 1476-4687 . PMC 1464427 . PMID 16056220 .   
  9. Green, Richard E.; Krause, Johannes; Ptak, Susan E.; Briggs, Adrian W.; Ronan, Michael T.; Simons, Jan F.; Du, Lei; Egholm, Michael; Rothberg, Jonathan M. (2006-11-16). “Bir milyon baz çift Neandertal DNA’sının analizi”Doğa444(7117): 330–36. Bibcode:2006Natur.444..330Gdoi: 10.1038/nature05336 . ISSN0028-0836PMID17108958S2CID4320907.   
  10. Palmer, Sarah A.; Smith, Oliver; Allaby, Robin G. (2012-01-20). “Bitki arkeogenetiğinin çiçek açması”. Annals of Anatomy – Anatomischer AnzeigerÖzel Sayı: Kadim DNA. 194(1): 146–56. doi:10.1016/j.aanat.2011.03.012PMID21531123. 
  11. Kolman, Connie J.; Tuross, Noreen (2000-01-01). “İnsan popülasyonlarının antik DNA analizi” . Amerikan Fiziksel Antropoloji Dergisi . 111 (1): 5-23. doi : 10.1002/(sici)1096-8644(200001)111:1<5::aid-ajpa2>3.0.co;2-3 . ISSN 1096-8644 . PMID 10618586.  kalıcı ölü bağlantı ]
  12. Lalueza-Fox, Carles; Gigli, Elena; Rasilla, Marco de la; Fortea, Javier; Rosas, Antonio (2009-08-12). “TAS2R38 geninin analizi yoluyla Neandertallerde acı tat algısı” . Biyoloji Mektupları . 5 (6): 809–11. doi : 10.1098/rsbl.2009.0532 . ISSN 1744-9561 . PMC 2828008 . PMID 19675003 .   
Reklam (#YSR)